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Hello,大家好呀，本期我们介绍一篇南方医科大学皮肤病医院于2021年6月17日发表于Nature Communications的文章，题目为 《Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases》IF： 。本研究通过使用单细胞RNA-seq，探索纤维化皮肤病范例瘢痕疙瘩中的成纤维细胞异质性。结果表明，瘢痕疙瘩中成纤维细胞可分为4个亚群：分泌-乳头状、分泌-网状、间充质和促炎性。有趣的是，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞亚群的百分比显著增加。这些发现将帮助我们更好地理解皮肤纤维化发病机制，并为纤维化疾病治疗提供潜在靶点。 单细胞RNA-seq揭示人纤维化皮肤病中成纤维细胞异质性和间充质成纤维细胞增加 研究背景 纤维化时以成纤维细胞增殖和细胞外基质(ECM)过度蓄积为特征，全球的发病率和死亡率较高。纤维化可累及任何器官，导致进行性组织瘢痕和器官功能障碍。纤维化性皮肤病涉及真皮中ECM成分的积聚，包括硬皮病、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩和移植物抗宿主病。纤维化皮肤病的全球影响显著，影响全球数百万人。迄今为止，纤维化皮肤病的病因发病机制尚未彻底阐明，目前尚缺乏根治方法。 许多导致纤维化的细胞类型，如血管内皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞已被确定。成纤维细胞是皮肤纤维化过程中的中心细胞类型，可导致ECM积聚和炎症。纤维化疾病中的成纤维细胞表现出明显的增殖潜能、迁移和侵袭能力增加以及ECM沉积增加，从而导致纤维化发病。这些作用主要由成纤维生长因子驱动，如TGFβ、FGF、PDGF、VEGF和POSTN。 长期以来，我们都认为成纤维细胞是梭形细胞群中的一种，然而，新出现的证据表明成纤维细胞实际上是形态和功能异质性的细胞群。单细胞RNA测序(scRNA-seq)的发展使我们有机会探索稳态和病理下皮肤的成纤维细胞异质性。scRNA-seq提示成纤维细胞在正常人真皮中可分为多个亚群。 scRNA-seq也被用于研究一些纤维化疾病中成纤维细胞的异质性，如肺纤维化、系统性硬化症和Dupuytren病。然而，据我们所知，关于scRNA-seq应用于探索纤维化皮肤病中成纤维细胞异质性的研究仍然缺失。在本研究中对纤维化皮肤病的范例瘢痕疙瘩中进行了scRNA-seq分析，探索纤维化疾病中成纤维细胞的异质性。 研究方法Sample: 共3例患者中采集瘢痕疙瘩组织; 建库方式：Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2 (PN-120237), Chromium Single Cell 3′ Chip kit v2 (PN-120236), Chromium i7 Multiplex Kit (PN-120262)； 比对：human genome (hg38) 细胞过滤：filtered by removing cells with high and low (>6000 and <200) UMI-counts； 基因富集分析：clusterProfiler ； 转录调控因子分析：ARACNe； 细胞间的交互分析：CellPhoneDB ； 伪时序分析：destiny R package 结果 结果（一）： 如图1所示，单细胞RNA-seq揭示正常瘢痕和纤维化皮肤病真皮组织的细胞异质性；作者鉴定出了5个成纤维细胞簇(C2、C4、C8、C14、C15)和3个内皮细胞簇(C1、C6、C7)，并对不同类型组织的细胞比例进行统计。在瘢痕疙瘩组织中观察到内皮细胞和平滑肌细胞比例增加，这与瘢痕疙瘩表现出血管生成增加的报告一致。与正常瘢痕组织相比，瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的比例降低，可能是内皮细胞和平滑肌细胞过度扩增所致。在比较瘢痕疙瘩和正常瘢痕中的基因变化时，作者发现成纤维细胞的差异最大（图1g），表明成纤维细胞在纤维化进展过程中发生显著变化。结果（二）： 真皮纤维化皮肤病中间充质成纤维细胞增加；在对所有瘢痕疙瘩和正常瘢痕成纤维细胞进行重新聚类，并分成13个细胞亚型sC1至sC13（图2a）。图2b，c显示了瘢痕疙瘩和正常瘢痕中成纤维细胞亚群的细胞比例。从结果可以看出，与正常瘢痕样本相比，瘢痕疙瘩样本中sC4的比例持续增加（图2b，c）。 在细胞亚群中，sC2、sC3和sC9是促炎性成纤维细胞，sC6和sC7是分泌-乳头状成纤维细胞，sC1和sC4是间充质成纤维细胞，sC5是分泌-网状成纤维细胞。特定胶原的表达与特定成纤维细胞功能相关。因此，作者还分析了4种成纤维细胞亚群的胶原表达水平。分析显示，胶原相关基因COL11A1在sC1和sC4成纤维细胞中特异性表达，表明在该细胞亚群中具有更多的间充质成分。 然后，作者比较了瘢痕疙瘩和正常瘢痕之间四个成纤维细胞亚群的比例。结果显示，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中分泌-乳头状、分泌-网状和促炎亚群的比例降低，而间充质亚群增加（图2f）。瘢痕疙瘩中间充质亚群的增加提示该亚群可能对瘢痕疙瘩发生非常重要。 接下来，研究者比较瘢痕疙瘩间充质成纤维细胞和正常瘢痕间充质成纤维细胞之间的差异，发现确定了骨骼系统发育、骨化和成骨细胞分化相关基因，如COL11A1、COMP和POSTN，在瘢痕疙瘩间充质成纤维细胞中表达显著增加。提示与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞的比例不仅增加，而且间充质成纤维细胞的同一性也发生了变化。结果（三）：真皮纤维化皮肤病中间充质成纤维细胞的特征；在研究瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞中研究人员发现，骨骼系统发育、骨化和成骨细胞分化相关基因如POSTN和COL11A1在间充质亚群中富集（图3a）。热图表明间充质亚群和其他亚群之间的基因表达存在显著差异（图3b）。间充质亚群中增加的基因包括一些分泌蛋白，如POSTN、COMP、COL11A1、COL12A1和COL5A2（图3c和补充数据2）。我们还发现，间充质亚群中的一些膜蛋白，如SDC1、ADAM12和CD266（由TNFRSF12A编码）增加，而CD9减少（图3c）。GO和GSEA分析表明，间充质亚群中上调的基因与胶原组织过程、伤口愈合、骨骼系统发育、成骨细胞分化等相关。 在转录调控分析中，作者发现一些成骨、软骨形成、韧带和肌腱分化相关的TF，如SCX、CREB3L1和RUNX2，在间充质成纤维细胞亚群中富集，与其间充质特征一致。结果（四）： 间充质成纤维细胞亚群中的潜在配体-受体相互作用分析；为了确定瘢痕疙瘩和正常瘢痕中成纤维细胞亚群和其他细胞之间的细胞-细胞通讯景观，使用cellphondb 进行了分析，其中包含了配体-受体相互作用。在正常瘢痕中，分泌网状成纤维细胞和其他细胞之间的相互作用最丰富（图4a），但在瘢痕疙瘩中，间充质成纤维细胞和其他细胞之间的相互作用最丰富（图4b），表明间充质成纤维细胞在瘢痕疙瘩发展中的重要作用。作者还发现在瘢痕疙瘩中NOTCH信号传导显著增加，如JAG1-NOTCH1（图4c，右图）。瘢痕疙瘩中与FGF2配体-受体相互作用相关的纤维化抑制显著降低，这与之前的报告一致。结果（五）： sC4成纤维细胞的分化程度可能低于sC1成纤维细胞。为了进一步探索瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞亚群的关系，作者对sC1和sC4成纤维细胞进行了伪时序分析。提示sC4成纤维细胞的分化可能低于sC1成纤维细胞。有趣的是，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中sC4成纤维细胞的比例显著增加。最后，作者在硬皮病公共数据中验证以上结论，证明间充质成纤维细胞增加可能是纤维化皮肤病的普遍机制。 参考文献： Deng, CC., Hu, YF., Zhu, DH.  et al. Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases. Nat Commun 12, 3709 (2021).

卡介菌多糖核酸 皮肤科 临床应用卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)是采用热酚法去掉蛋白质研制成的新一代卡介菌提取物，具有免疫调节作用。研究[1,2]表明它能通过调节机体内的细胞免疫、体液免疫、刺激网状内皮系统，激活单核－巨噬细胞功能，增强自然杀伤细胞功能来增强机体抗病能力；还通过稳定肥大细胞，封闭IgE功能，减少脱颗粒细胞释放活性物质，达到抗过敏作用。近年来，卡介菌多糖核酸更广泛应用于临床，现就其应用于皮肤科的临床研究作一综述。1 病毒性皮肤病 疣欧春荣[3]报道称将治疗组52例尖锐湿疣患者先用二氧化碳激光治疗，当日开始肌注BCG-PSN mg，隔日1次，疗程1个月。对照组仅用激光治疗。结果治疗组痊愈率，复发率；对照组痊愈率，复发率，两组痊愈率和复发率差异有显著性(P<)。朱国军[4]对扁平疣37例、寻常疣26例患者中治疗组采用BCG-PSN肌内注射每日 mg，每周3次。对照组采用聚肌胞2 mg肌内注射，隔日1次，均连续6周。结果显示治疗组和对照组治疗扁平疣有效率分别为和，差异有显著性(P<)，治疗寻常疣有效率分别是和(P>)。且治疗组治疗扁平疣4周后痊愈16例，显效7例；对照组痊愈7例，显效6例。治疗组治疗寻常疣4周后痊愈7例，显效3例；对照组痊愈4例，显效3例。提示BCG-PSN起效时间较聚肌胞短。 生殖器疱疹敖俊红等[5]应用ELISA法和APAAP法检测30例BCG-PSN治疗前、后生殖器疱疹患者单核细胞产生TNF-α、IL-6水平和HLA-II类抗原水平。结果显示BCG-PSN能提高患者单核细胞产生TNF-α、IL-6及HLA-II类抗原水平，可以作为生殖器疱疹的辅助治疗手段之一。 带状疱疹，水痘，手足口病潘红梅等[6]运用BCG-PSN与灯盏细辛注射液治疗联合治疗带状疱疹患者69例，对照组76例用复方丹参注射液治疗，连用2周。结果，治疗组显效率、有效率明显优于对照组(P<)。对照组疼痛消失平均为5 d，对照组为15 d，差异有显著性(P<)。阳剑锋[7]对45例患儿(其中水痘32例，手足口病13例)均给予斯奇康肌肉注射 mg /次，隔日1次，疗程3次～5次，均未给口服药物。结果，所有病例注射斯奇康3次～5次后全部治愈，其中34例2次～4次后水疱吸收，瘙痒感觉减轻，余11例在注射第5次亦治愈。2 皮炎、湿疹宋春丽[8]等采用NF-KB P65 ELISA试剂盒检测NF-KB，特应性皮炎患者外周血单一核细胞经BCG-PSN干预后NF-KB活性降低，细胞因子IFN-γ、IL-12明显升高，IgE水平下降(P<)，IL-4干预前后则无明显升高(P>)，干预前后NF-KB活性变化量与TFN-γ,IL-12表达水平呈明显负相关。可见BCG-PSN通过抑制NF-KB的活性，上调TFN-γ,IL-12表达而发挥治疗作用。赵黎荣[9]报道皮炎湿疹类疾病患者治疗组口服皿治林10 mg，1次/d，BCG-PSN 1 ml隔日1次肌肉注射，对照组仅用口服药，4周为1疗程，于治疗后第14天、第28天复诊。结果14 d时治疗组和对照组有效率为56%和50%，差异无显著性(P>)；28 d时两组有效率为94%和60%，差异有显著性(P<)。3 荨麻疹韦无边等[10]报道对照组56例慢性荨麻疹每晚口服赛庚啶2 mg，外用止痒药物，观察组58例加用BCG-PSN肌肉注射(≥14岁每次1 mg，<14岁每次 mg)，隔日1次，共用2个月。结果显示，观察组治愈率，总有效率，6个月复发率为，与对照组差异有显著性(P<)。可见BCG-PSN对慢性荨麻疹具有较好疗效，且可减少复发。4 白癜风任虹等[11]对治疗组49例白癜风患者采用窄谱中波紫外线与BCG-PSN联合治疗，对照组49例单用窄谱中波紫外线治疗，对两组皮损面积大的进展期患者进行疗效分析。结果治疗组和对照组有效率分别为和，差异有显著性(P<)。进展期患者治疗组和对照组有效率为和，差异有显著性(P<)。5 红斑及红斑鳞屑性皮肤病李永喜等[12]用ELISA法检测30例来源于正常对照组、银屑病组及BCG-PSN组外周血单一核细胞培养上清液中IFN-γ和IL-4的量，结果BCG-PSN组IFN-γ水平明显低于银屑病组而高于正常对照组(P<)，IL-4水平在3组间无明显差异(P>)。BCG-PSN可通过降低IFN-γ水平而对银屑病起到治疗作用。周聪和等[13]将治疗组34例玫瑰糠疹患者肌注BCG-PSN每次1 mg, 隔日1次，21例对照组肌注维生素B12500 μg，每日1次，口服酮替芬、维生素C、葡萄糖酸钙，外涂复方炉甘石洗剂，每日3次，共治疗3周。结果：治疗组有效率，对照组有效率，因此，BCG-PSN治疗玫瑰糠疹有一定临床疗效。6 痤疮甄莉[14]将治疗组31例寻常性痤疮患者口服黄柏胶囊及肌注斯奇康1 ml/次，隔日1次，共7次。对照组29例口服黄柏胶囊。结果显示，两药联合有效率77%，对照组49%，差异有显著性(P<)。7 过敏性紫癜王哲等[15]将对照组30例过敏性紫癜患者常规治疗，治疗组42例加用BCG-PSN肌肉注射1 ml/次，隔日1次；6次后每周2次；6次后改为每周1次，共6次，总疗程3个月。结果，治疗组总有效率，明显高于对照组(P<)，BCG-PSN可提高过敏性紫癜疗效，缩短病程，促进患者病情康复。8 非淋菌性尿道炎黄永华等[16]报道将非淋菌性尿道炎治疗组60例采用BCG-PSN肌肉注射2 ml，隔日1次，14 d为1疗程，联合口服可乐必妥 g，2次/d，共10 d。对照组56例单用可乐必妥口服治疗。结果，治疗组总有效率为，显著高于对照组(P<)，BCG-PSN联合可乐必妥治疗非淋菌性尿道炎可获得较好临床疗效。【参考文献】[1] 刘桂珍, 姜志平, 吴晋湘, 等. 卡介菌多糖核酸的抗炎和抗过敏作用[J].中国药理学通报,2004,20(10):1177-1181.[2] 陈兴平, 李永喜 ,邓云华, 等. 卡介菌多糖核酸对免疫抑制小鼠T淋巴细胞亚群的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2002,31(3):336-348.[3] 欧春荣.二氧化碳激光联合卡介菌多糖核酸治疗尖锐湿疣52例疗效观察[J].岭南皮肤性病科杂志,2006,13(1):34-35.[4] 朱国军.卡介菌多糖核酸对扁平疣,寻常疣的疗效观察[J].临床军医杂志,2005,33(5):587-588.[5] 敖俊红, 杨蓉娅, 郝震锋, 等. 卡介菌多糖核酸对生殖器疱疹患者单核学报功能的影响 [J].中国皮肤性病学杂志, 2006, 20(2):745-746.[6] 潘红梅,周 健,陈明珠.灯盏细辛注射液与斯奇康联合治疗带状疱疹69例疗效观察[J].云南中医中药杂志,2005,26(3):29.[7] 阳剑锋. 斯奇康治疗45例小儿病毒性皮肤病的临床观察 [J]. 华夏医学,2001,14(6):962.[8] 宋春丽, 文海泉, 肖山荣, 等. 卡介菌多糖核酸调节特应性皮炎患者PBMC中NF-KB和Th1/Th2细胞因子的表达[J].中华皮肤科杂志,2007,40(1):42-44.