心在翠微
基因克隆技术给人类生活带来美好的前景，故寄予了无限的期望。下面是我整理了基因克隆技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!
差异表达基因克隆技术的新进展
提要 分离并克隆差异表达基因是 目前 功能性基因 研究 的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及 应用 ，这些技术将会不断完善与 发展 ，具有广阔的应用前景。
关键词 差异表达基因;克隆
现代 分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与 治疗 提供重要的 理论 依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。
一、mRNA差异展示
mRNA差异展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5´端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3´端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3´端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端锚定引物与5´端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5´端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3´端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。
总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列 问题 ，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。
二、代表性差示 分析
代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增目的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72℃ 复性与延伸及95℃变性这两个循环参数，共20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表达，则难达到预期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期长。
三、抑制性扣除杂交
抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一种新的克隆基因技术，其基本原理是：先将T与D方cDNA用限制酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复发，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适引物接头(接头1与接头2引物)进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受到抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。
此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基因，与DDRT-PCR相比，具有假阳性少重复性强的优点，它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较。
四、差异消减展示
差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与对照方的相应范围的条带，靶方回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，而对照方回收的差异条带用含生物素标记的dATP的dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTPs进行扩增，再重复差异展示，回收差异条带并克隆。此技术最大的优势是获得差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少，敏感性强，可获得长片段，起始材料要求少，可获取低丰度差异表达基因，缺点是步骤繁琐，工作量大，周期性长，更多依赖于PCR技术。
另外，赵忠良博士把长片段PCR扩增(LPCR)与消并减杂交技术结合起来，建立了LPS技术，并运用此技术从抗原呈细胞中获取了170多个差异表达基因。此技术的基因原理是：T与D方分离出cDNA后，运用5´端帽子引物与3´端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，其产物直接进行消减杂交，然后过柱子，去除相同的基因，剩余的部分再与D方cDNA进行二轮消减杂交，再过柱子，去除非差异部分，剩下的差异部分进行第三轮消减杂交，其产物进行分级分段克隆。这种 方法 最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。
总之，随着高效扩增的Taq酶与具有自动校正功能的Taq酶的出现，长片段PCR扩增技术的优化，差异表达基因克隆技术将会不断 发展 ，但 目前 主要有以上几种方法，各有其优缺点， 研究 者应根据自己的实际情况，选择合适的技术方法，以其达到自己预期的目的。
参考 文献
1 Liang P et (14):967
2 Ito T et letters,1994;351:231
3 Ayala M et ;18(5):842
4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat ) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12
5 Cui DX et of the Fourth Military university,1998;18(6):601
6 Hubank M et Acids Res,1994;22:5640
7 Diatchenko L et Natl Sci USA,1996;93:6025
8 Jose RP et Biochemistry,1998;257:161
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爱我大兴
一、克隆技术的科学意义及经济价值 克隆技术的突破,首先标志着人类对生命的认识水平与改造能力的提高,这本身是人类文明的长足进步。作为生物工程的一项重要成果,克隆技术为解决某些日益尖锐的问题和矛盾提供了多种可能的途径和方法。 (一)克隆技术给医学领域带来美好应用前景。在人类基因组的带动下,人们正在进行治疗性克隆试验,旨在生产克隆的或单性生殖的人类胚胎以获取干细胞,为人类研究癌症、艾滋病、老年痴呆、帕金森氏症等疑难病症,从基因层面揭示疾病产生的分子生物学机制,预报人体的机能和病理变化,找到标本兼治的治疗方法。克隆生物工程技术将克服中西药的弊端,将使医学在21世纪发生革命性的变化。治疗性克隆和干细胞研究为人体缺失器官的修复和重建带来希望,不但能治疗或预防器官功能衰竭,而且能防治衰老,解决目前我们面临的寿命延长而生命质量低下的难题。寿终无年、青春常驻的梦想在21世纪有可能会逐步成为现实。 (二)克隆技术有助于加速动植物育种过程。作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破,克隆技术反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步,为挽救濒临灭绝物种提供了多种可能和广阔的发展前景。利用优良动物品种的体细胞提供细胞核来克隆动物,可以避免自然条件下育种所受到的动物生育周期和生育效率的限制,缩短育种年限,提高育种效率,按照自己的意愿创造出有更高经济价值的动物新品种来;可以再现物种,保护和拯救濒危动物。同时,运用克隆技术可以超越自然节奏,主动调控生物链及生态环境,减少环境污染,保护地球这一万物共有的家园。 (三)克隆技术将引起制药业和农业生产的革命。利用体细胞克隆技术使外源基因整合到受体细胞中并稳定地遗传到子代,可以用来大量繁殖许多有价值的基因,直接生产出人类适用的医药用蛋白等高效药物。如治疗糖尿病的胰岛素、有希望使侏儒患者重新长高的生长激素和能抗多种疾病感染的干扰素等。克隆山绵羊将会出现人类新的制药厂,生产人类健康需求的应有尽有的药用动物或动物药。据计算,一头转基因山羊一年提供的人凝血因子LX活性蛋白相当于上海全年献血总量所含同类蛋白的总和。人们一旦突破克隆生物技术,就能改变农作物的基因型,产生大量抗病、抗虫、抗盐碱和 遗传性质稳定的新品种,培育动物的优良品种,培育生产奶量高,奶中富含人体所需营养物质的乳牛,以满足人体对营养的需求。 二、克隆技术的负面作用与问题思考 科学技术是一把双刃剑,它对于社会的作用是双重的,克隆技术也不例外。克隆技术的发展伴随着对伦理道德的影响的冲击,其负面作用不容忽视。 自“多莉”羊诞生以来,关于克隆技术的争论日渐激烈。克隆技术的迅速发展,不仅为自然科学领域瞩目,也受到了社会科学领域的科学家的关注。因为,一旦这一技术被应用于人类自身,既克隆人的产生,那将是对人类社会伦理道德的一项严峻挑战。克隆人可能对社会道德、社会伦理产生不可预料的负面影响:第一,它危害了伦理学的不伤害原则。从“多莉”羊的实例可以看出克隆动物的成功率很低,如果在人身上做成功率可能更低,而且很可能会产生出许多畸形的、具有严重缺陷的克隆人,自然会造成对他们的伤害;第二,克隆人违背了伦理学的自主原则。被克隆者作为人所享有的独特性被粗暴的剥夺了;第三,克隆人违背了伦理学的平等原则。克隆人也是人,我们不能将他们仅仅当作为他人的目的服务的手段和工具。 对克隆技术持否定态度的人看到了克隆人可能引发的一系列社会、伦理、法律等问题。从政治角度看,克隆人的出现可能使人类自身的安全受到威胁;从经济角度看,克隆人可能使人的生产劳动发生畸形分化,如让克隆人当奴仆以及作为人的工具;从人类学和社会学角度看,克隆人与供体者的关系将是社会不稳定的潜在因素;从法学角度看,克隆人将给法治社会制造不易化解的困境;从心理学角度看,克隆人有难以逾越的心理障碍;从进化论角度看,克隆人不利于人类的进化;从哲学角度看,克隆人消除人的个性,破坏人类的多样性。在克隆人可能引发的社会性问题中,最大量、最复杂的恐怕还是道德伦理问题。从社会伦理角度看,克隆人对人类发展的干预会影响人种的自然构成和自然发展。克隆人的出现将使两性结合繁殖后代的传统生殖模式被打破、人伦关系模糊以及人口性别比例失调,甚至可能被别有用心的人利用制造人类灾难;从家庭伦理角度看,克隆技术用于人体繁殖,会加剧家庭多元化趋向,还会从根本上改变人的亲系关系,确定人类亲系关系的标准也将发生改变;从性伦理学角度看,它完全改变了人类自然的、基于性爱的生育方式,使人口的生产与性爱分离,破坏人类的情感;从生命伦理学角度看,它破坏了人拥有独特基因的权利,有可能导致人种的退化,还会使正常的生与死的概念发生动摇。
重塑新我
1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。 （如果我的回答能够解决你的问题，请采纳，谢谢……！！！）
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