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大力非水手
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萤火虫696969

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RAS是第一个被发现的人类肿瘤基因(oncogene),也最常见的突变基因之一,30%的肿瘤携带RAS变异,加上RAS调控因子和信号通路上下游的变异,几乎覆盖所有肿瘤。 KARS基因编码的蛋白是一种小GTP酶,它属于RAS超蛋白家族。RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS(3%突变引起癌症)、KRAS(85%突变引起癌症)和NRAS(12%突变引起癌症),其密码子12、13、61的突变较为频繁,这些突变在不同的癌症中也表现出了不同的患病率。 RAS信号通路 RAS将细胞表面受体与细胞内效应通路偶联,是细胞生长和分化的关键调节剂。 GTP 和 GDP 的结合分别使 Ras 蛋白在“开”和“关”信号构象之间循环。在生理条件下,这两种状态之间的转变受到鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)的调节,该因子通过上游信号刺激使 GDP释放和GTP促使 Ras 蛋白的活化;而RAS蛋白本身具有GTPase的活性,可以促使GTP水解。 激活的KRAS蛋白将上游刺激信号传递到胞内,从而调控细胞的增殖、分化、存活和凋亡等生命活动。RAS在体内调控着多种信号通路,研究最多的主要包括以下三种信号通路:(1)PI3K-AKT-mTOR通路,对细胞增殖分化凋亡、葡萄糖转运等细胞生命活动有重要影响;(2)Ras-Raf-MEK-ERK信号通路,参与调控细胞增殖、分化、迁移、免疫应答等生命活动;(3)Ras-Ral A/B-NF-kB信号通路,参与调控细胞增殖、生命周期等生命活动。 KRAS靶点药物研发方向 KRAS一度被认为是“不可成药”靶点,这主要是因为KRAS蛋白表面十分光滑,没有一个pocket,给药物附着点;以及KRAS对于GDP/GTP 皮摩级别的亲和力,底物类似物很难去与GTP竞争。目前药物研究方向主要是以下几种: 1. 直接靶向KRAS (1) Sotorasib(AMG510):2021年5月28日,美国FDA批准Sotorasib上市,这是首个靶向KRAS基因突变的药物。2013年,Sotorasib(AMG510)的出现,打破了KRAS“不可成药”的魔咒,AMG510是一种选择性的KRAS G12C抑制剂,通过一个丙烯酰胺弹头和KRAS第12位甘氨酸突变成的的半胱氨酸共价结合,从而占据了switch II region将KRAS G12C锁定在KRAS GDP状态,从而抑制下游的信号传导。9月20日,根据安进公布了Sotorasib完整的I期试验结果。该I期试验共招募了129例患者,在59例非小细胞肺癌中,所有剂量均可以看到对癌症的抑制效果,36%的患者显示出明显的客观缓解(CR)。 (2) MRTX849:Mirati Therapeutics同样很早就在KRAS这个靶点开始布局,其MRTX849同样利用丙烯酰胺弹头靶向KRAS G12C的Swith II region,并且与KRAS(G12C) α3螺旋中的H95残基的相互作用增强增加了其效力,能够有效的抑制小鼠的异种移植瘤生长。在KRAS(G12C)突变肿瘤患者中也显示出了临床活性。紧接着10月25日,第32届AACR上也展示了MRTX849的最新临床数据,MRTX849治疗突变的晚期、转移性非小细胞肺癌ORR达到45%;对于直肠癌ORR为17%。 目前,全球共有6款KRAS(G12C)抑制剂进入临床开发阶段,除了安进、Mirati、礼来等公司,还有中国的益方生物D-1553,在临床上主要治疗实体瘤。从公布的抑制剂结构来看,这些KRAS G12C抑制剂共享一个丙烯酰胺弹头,但不同的化学结构使得它们在溶解性和细胞毒性方面也有所不同。 (3) MRTX1133:Mirati Therapeutics公司在第32届AACR上,公布了KRAS G12D选择性抑制剂MRTX1133的研究进展,这也是报道的第一篇KRAS G12D抑制剂。MRTX1133目前处于临床前阶段,根据会议上的展示来看,MRTX1133可以抑制KRAS G12D失活和活化两种状态下的KRAS G12D突变细胞,且不抑制野生型肿瘤细胞,在胰腺癌和结肠癌上的均表现出很好的抑制活性。相比较KRAS G12C抑制剂而言,KRAS G12D的天冬氨酸残基没有很好的共价修饰物,而且KRAS G12D的GTPase活性比KRAS G12C要低很多。这就需要KRAS G12D抑制剂必须具有和GDP KRAS G12D 更高的亲和力,Mirati Therapeutics基于KRAS G12C抑制剂Adagrasib进行了改造,最后依据吡啶并嘧啶支架作为骨架,对其他位点不断优化,最终得到MRTX1133. 虽然报道的MRTX1133显示在KRAS G12D和WT上表现出了很好的选择性,但是根据我们在Active KRAS to RBD测试结果来看,MRTX1133在KRAS G12D/G12C/G12V/WT的酶学实验上面的IC50均在10nM左右,并没有明显的选择性。 2. 靶向鸟苷酸交换因子 由于SOS1单个激活就会依次激活多个RAS分子,从而扩大RAS信号。通过阻止KRAS-SOS1的相互作用,可以有效的阻断GTP重新加载到KRAS上。目前多个SOS抑制剂正在临床试验阶段,如BAY-293、BI 3406等。但是由于SOS1抑制剂同样与野生型的KRAS结合,并不适用于RAS突变患者的治疗。但是,SOS1抑制剂与KRAS G12C抑制剂联用的试验表现出协同性,能够帮助KRAS抑制剂更好的结合到KRAS上。 3. 靶向KRAS定位 体内的KRAS被上游信号激活,从而激活下游信号通路,需要KRAS蛋白先定位到细胞膜上。RAS蛋白在胞质内合成,具有低疏水性,不能结合到细胞膜上,必须由法尼基转移酶进行修饰,增强其疏水性,才能结合到细胞膜上。目前也有多种法尼基转移酶抑制剂,但是由于胞内存在其他替代修饰,抑癌效果并不明显,且这类抑制剂多数有细胞毒性,这也是限制这类药物发展的一个重要原因。 4. 抑制下游信号通路 针对KRAS下游通路的蛋白也开发出了很多的药物,但由于RAS下游有多个信号通路,所以抑制下游蛋白并不能代替直接抑制Ras蛋白带来的效果。 5. RNAi 通过设计针对KRAS突变的小干扰RNA(siRNA),直接在体内靶向KRAS突变蛋白,也是目前研究的一种方向。阿斯利康与Ionis合作开发的AZD4785是一种抑制KRAS的反义寡核苷酸抑制剂,但由于能够引起多种副作用,已经被终止。Molecular Cancer研发靶向KRAS突变mRNA疫苗mRNA-5671处于1期临床研究,更多的临床数据尚不可知。相比较其他几种抑制剂,mRNA通过是编码KRAS肿瘤特异性抗原,通过主要组织相容性复合物(MHV)分子被T细胞识别。 除了以上几种策略,还有合成致死、靶向蛋白降解等方式,但是目前都处于早期研究阶段。针对KRAS抑制剂不同方向,我们提供了KRAS抑制剂筛选平台,包括KRAS泛抑制剂,SOS1抑制剂,下游信号(如:RTK、MEK、ERK、PI3K、AKT、SHP2等)抑制剂以及靶向降解技术等。 我们目前已经拥有多种KRAS突变筛选平台,并且有多种阳性药的验证结果。除了常规筛选,也拥有KRAS与小分子(tracer)相互作用、KRAS-PROTAC相关平台的构建经验。 多种检测靶点助力KRAS抑制剂(BI-2852)、SOS1抑制剂(BAY-293/BI-3406)、KRAS G12C抑制剂(AMG510)、KRAS G12D抑制剂(MRTX1133)等抑制剂的筛选。 参考文献 1. Zehir A, Benayed R, Shah RH, et al. Nat Med. 2017;23(6)703-713. 2. Krakstad C, Birkeland E, Seidel D, et al. PLoS One. 2012;7(12):e52795. , ., Mattos, Spring Harb. Perspect. 2018,Med. 8. Kim et al. Cell(2020). 5. McCubrey J A, Steelman L S, Chappell W H, et al. Biochim Biophys Acta, 2007, 1773(8): 1263-1284. 6. Chang F M , Steelman L S, Shelton J G, et J Oncol, 2003, 22(3): 469-480. J, Rex K, et al. Nature, 2019, 575(7781): 217-223. R, Fakih MG, Price TJ, et al. IASLC 20th World Conference on Lung Cancer, Barcelona, Spain: 2019. RC, Sautier B, Schroeder J, Et al. Proc Nat Acad Sci USA, 2019, 116(7): 2551-2560. 10. Kamerkar S, Lebleu VS, Sugimoto H, et al. Nature, 2017, 546(7659): 498-503. , ., Nissley, ., McCormick, F., 2017. Cell 170, 17–33. , ., 2019. PLoS Genet. 15, e1007870

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aimyforever

2001年国内在药物设计和分子模拟领域取得的主要进展和成就。总的说来,三维定量构效关系方面的工作较多,并且与实验紧密结合;分子模拟领域的工作相对水平较高,既有方法方面的研究,也有在具体体系中的应用;而由于知识产权方面的原因,目前基于结构的药物设计与虚拟筛选等方面的工作发表较少。 关键词:三维定量构效关系,分子动力学,基于结构的药物设计,分子对接 计算机模拟已经成为继实验、理论之后的第三种研究手段,在科学的各个领域都得到了广泛的应用,并且发展迅速。药物设计与分子模拟也是如此,其总体趋势是计算精度越来越高,与实验结合日趋紧密。近年来,国内药物设计与分子模拟研究工作取得了长足的进展,其中,定量构效关系在药物研究中的应用广泛,已成为药物结构改造的一个有力工具;分子模拟研究发展较快,计算的方法多样化,模拟的时间、空间尺度也越来越接近真实体系,取得了一些水平较高的成果。 一、定量构效关系 定量构效关系是最早发展起来的一种分子设计方法,一旦确定已知的化合物的生物活性与其结构之间的定量关系,研究者就可以依据这一关系对化合物结构进行改造,以获得更高的活性。3D-QSAR(尤其是比较分子力场分析方法)由于其预测能力强,模型形象、直观,已成为最常用的药物设计方法之一。 噻唑烷二酮和芳酮酸类等PPAR激动剂,能够增强胰岛素与其受体结合的信号传导,促进脂肪代谢。利用比较分子力场分析方法对这两类化合物进行了三维定量构效关系研究,揭示了芳酮酸类化合物比噻唑烷二酮类化合物活性更高的原因,并推测PPAR与这一类化合物结合时,活性位点的形状可能和与罗咯列酮结合时不一样[1]。 双叔丁基苯基杂环化合物是COX-2的抑制剂,具有抗炎作用。对三类含双叔丁基苯基杂环化合物进行三维定量构效关系研究,在三种可能的叠合模型中,选择了交叉验证结果最好的一种。研究结果表明:静电作用对化合物的活性贡献稍大于范德华作用;增加杂环的正电荷,可以提高化合物的活性[2]。 采用比较分子力场分析方法对1-咪唑基苯并二氮杂卓(草头卓)类法尼基蛋白转移酶抑制剂进行研究,发现在苯并二氮杂卓(草头卓)中的苯环上增加取代基的体积会使化合物活性降低,在咪唑环上增大取代基的体积能够提高化合物的活性[3]。 吡里酮类化合物是一类很有药用前途的抗炎镇痛剂,利用计算机辅助药物设计专家系统(Apex-3D)研究了5,6-二芳基取代吡里酮类化合物的抗炎活性与其分子结构之间的定量关系。研究表明:化合物的活性与吡里酮环的1位取代基的电荷密度正相关,而与分子的疏水性负相关[4]。 采用比较分子力场分析方法分析了一组-羟基丁烯羟酸内酯类内皮激素拮抗剂的结构活性关系。在计算中,除考察静电场和立体场之外,还引入了氢键场。结果表明,引入氢键场可以明显地改善计算结果。另外,还分别考察了格点距离以及探针原子类型对计算结果的影响[5]。 采用一系列几何结构参数以及由ClogP软件计算得到的logP值作为结构参数,对21个钾离子通道开放剂进行了定量构效关系研究。研究结果表明,氢键受体原子与疏水部分中心距离HA-Hy,以及芳环中心垂线和芳环中心与疏水部分中心连线的夹角对动脉舒张活性影响较显著[6]。 利用CATALYST软件得到了酪氨酸激酶抑制剂的三维药效基团模型,所研究的两类化合物具有完全不同的骨架,但其药效基团相似,说明两者的结合模式相似。这两类化合物的药效基团包括一个氢键受体,一个氢键给体,一个脂肪类疏水团和一个芳香类疏水团。在此基础上,进行了三维构效关系研究[7]。 以黄酮为模板,对一系列黄酮类化合物进行了定量构效关系研究及从头算研究。根据CoMFA, CoMSIA和HQSAR分析以及静电势计算结果,提出了合理的药效基团模型,并提出了一种黄酮类化合物与GABAA受体结合的模型[8]。 二、基于结构的药物设计 基于结构的药物设计是寻找新结构的药物先导化合物的方法之一,国内运用基于结构的药物设计方法发现活性化合物的例子也越来越多,不过,因为知识产权等方面的原因,这方面的论文发表较少,因此本文仅能介绍方法的发展。 在对已知抑制剂与磷脂酶A2的复合物晶体结构的分析的基础上,设计了新的抑制剂,并利用SCORE程序对其生物活性进行了预测。随后进行了化学合成及药理测试,结果表明设计的两种化合物都有一定的活性,并且实验值与SCORE的预测值具有对应关系[9]。 利用同源模建方法、序列进化踪迹分析,研究了蛋白质前提加工酶furin/kexin与水蛭抑制剂(eglin C)突变体的相互作用模式,阐明了furin/kexin各个亚类的底物/抑制剂的共性和差异性。在此基础上,利用界面再设计策略进行了furin/kexin抑制剂的理性再设计[10]。 对DycoBlock(Dynamically Assembling Molecular Building Block)方法进行了改进,主要包括利用结合能和溶剂可及性表面积(SASA)对DycoBlock产生的分子进行筛选,并发展了一个基于分子相似性的分类方法。利用COX-2及其选择性抑制剂SC-558对其方法进行了测试,重现晶体结构的比率由以前的上升到[11]。在DycoBlock的基础上发展了F-DycoBlock,在进行多拷贝随机分子动力学的过程中,一方面考虑小分子配体柔性,同时考虑小分子配体的平均场对大分子的影响,因而还可以考虑蛋白质的柔性。利用COX-2以及HIV-1蛋白水解酶两个体系对其进行了测试[12]。 三、分子模拟 分子模拟通过对生物大分子的结构和动力学行为的模拟,为阐明其结构、生物功能提供了丰富的信息。一般来说,这些信息用实验方法获取是比较困难的,因此,分子模拟已成为研究生物大分子结构和功能的一种重要手段。 Threading方法对于根据同源性比较低的模板蛋白预测目标蛋白三维结构已经取得一定的成功,但仍难以处理那些模板蛋白以及目标蛋白三维结构相似,而二级结构在序列中的顺序不一致的情况。研究发现预先对目标序列中的交错的二级结构片段作适当的调整,可以显著地提高Threading方法的预测能力[13]。 利用蒙特卡罗方法对蛇毒神经毒素的八种不同Loop III序列在自由态以及与短链神经毒素埃拉布毒素b(Erabutoxin b)结合状态的构象性质进行研究,发现远程作用确实对蛋白质表面的Loop区的构象及稳定性有影响,而近程作用只是提供候选的构象,还须经过远程作用的过滤[14]。 BLIP是目前效果最好的TEM-1-内酰氨酶的蛋白类抑制剂,它的结构域1中的一个转角结构B1可以与TEM-1-内酰氨酶的活性部位结合,从而抑制其活性。利用圆二色谱、傅立叶红外光谱和核磁共振谱研究了B1在磷酸盐缓冲溶液中的构象,结果表明,B1在溶液中形成了转角结构 [15]。 采用分子动力学方法对猪胰岛素二聚体进行模拟,并利用连续介质模型有限差分方法计算二聚体的静电势,利用溶剂可及性表面分析二聚体的疏水性,还考察了不同的PH值对二聚体的静电作用和疏水作用的影响。分析表明,在弱酸弱碱条件下,二聚体的静电作用和疏水作用比较有利;在PH值为时,二聚体的疏水作用最佳[16]。 利用分子动力学方法对喜树碱进行构象搜寻,并利用AM1,PM3以及ab initio方法对与晶体结构比较接近的构象进行优化。ab initio方法优化得到的结构与晶体结构更接近,喜树碱E环内酯部分形成了分子内氢键,使其内酯键反应活性提高,使其易受水的影响开环而失去活性。研究还表明,喜树碱在与TopoI-DNA复合物作用时,要破坏分子内氢键,能量补偿较大[17, 18]。 采用快速退火进化算法对氨基酸与-环糊精的结合进行了模拟。对14种包合物的结合常数与作用能的线性回归分析表明,两者之间存在非常好的相关性。通过对作用能进行分析,发现范德华作用起主要作用。对不同手性的氨基酸与-环糊精的作用能进行了比较,解释了-环糊精的手性选择性[19]。 利用自由能微扰方法计算了两种hydroxamate类的抑制剂和MMP-3的相对结合自由能。自由能计算采用了慢增长和固定窗口增长两种方法,并且都采用了双向采样策略。计算得到的结合自由能与实验值吻合得很好,同时从动力学模拟的轨迹分析了抑制剂与MMP-3之间的重要相互作用[20]。 通过同源模建方法得到了枯草杆菌(Bacillus subtilis)色氨酸tRNA合成酶的三维结构,分析结果表明合成酶的二级结构含有16个螺旋和5个折叠,唯一的色氨酸Trp92位于两个亚基的界面上。另外,还对配基结合位点、活性位点以及与tRNATrp可能的结合方式进行了预测[21]。 蛋白质的折叠是一个自由能驱动的过程,天然的蛋白质构象处于一个热力学的低能量态。基于蛋白质结构域是折叠单位的设想,蛋白质结构域作为一个独立的折叠单元,应该不仅在结构上相对致密,而且在能量上也应该相对稳定。因此,用折叠自由能来划分结构域更为合理。利用去折叠自由能的方法对50种不同的双结构域蛋白质进行了结构域分析,大多数划分结果与文献一致;少数结果虽然与文献不一致,但去折叠自由能方法的划分结果可能更合理[22]。 采用布朗动力学对蝎毒Lq2与钾离子通道的结合进行模拟,蝎毒的三维结构取自NMR实验测定的22个结构,结果表明只有4个结构能够以高概率和较好的静电作用与钾离子通道结合。对上述4种结构进行三联体接触分析,构建了复合物的三维结构模型,并确定了Lq2与钾离子通道之间的主要相互作用[23]。 采用同源模建和分子动力学方法,模建了memapsin 2蛋白水解酶的三维结构。memapsin 2蛋白水解酶的活性部位为一个富含-折叠的结构域所支撑,活性部位通过一段螺旋与该结构域连接。-发夹结构中的Tyr132是天冬氨酸蛋白水解酶的共同特征。分析表明,虽然M2蛋白水解酶的结构比较独特,但仍属于天冬氨酸蛋白水解酶超家族[24]。 四、数据库与虚拟筛选 如果已经掌握了足够的有关靶标以及与靶标结合的化合物的信息,针对大的化合物数据库的虚拟筛选非常具有吸引力,并可作为一种与高通量筛选互为补充的寻找先导化合物的方法。最近,在超级计算机上对Kuntz发展的DOCK程序进行了并行化,大大加快了数据库筛选的速度。采用这种方法,从商用的化合物数据库以及中国天然产物数据库中找到了一系列对钾离子通道,-分泌酶以及PPAR等靶标具有生物活性的化合物。但由于要申请专利,结果还没有发表 一个包含范德华作用、金属配位作用、氢键作用、去溶剂化作用以及小分子构象变化等项的打分函数SCORE,被用于评价DOCK4找到的小分子与蛋白质的结合构象。用两者结合得到的程序SCOREDOCK对200个蛋白-配体复合物进行测试,发现SCORE能够明显地提高DOCK计算精度[25]。 通过Fortran PowerStation和Visual C++混合编程,将在DOS下运行的、用于研究分子结构和生物活性关系的计算机辅助筛选生物活性化合物软件(Computer-Aided Screening bioActive Compounds, CASAC)移植到Windows系统[26]。 基于XML(eXtensible Markup Language),构建了海洋天然产物数据库,目前数据库中包含了大约11000种海洋天然化合物的分子结构及其生物来源、生物活性、药效、物理化学参数和参考文献等信息。与XML的集成有利于该数据库的管理、查询、Web发布、数据交换以及未来的扩展,目前已具备Web检索的功能[27, 28]。 提出了一种将遗传算法与随机搜寻相结合的分子对接算法,并采取分步考虑形状互补和能量最优的策略。对随机选取的8个复合物结构测试结果表明:计算所得构象及取向与晶体结构接近,大部分情况下,最小的均方根偏差小于[29]。 5,6-二芳基取代吡里酮类化合物是一类新型的抗炎镇痛剂,利用分子对接方法研究了这一类化合物的作用机理。从分子对接结果来看,ZZ-122与COX-2结合的比较好,静电作用和范德华作用都是负值,范德华作用是主要作用;而与COX-1结合构象严重扭曲,两者之间存在强烈的范德华斥力。这一结果表明,该类化合物可能是比较好的COX-2选择性抑制剂[30]。

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