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建筑设计中灯光运用人类的生活天天与光相伴，建筑和城市与光息息相关。光显示出的巨大艺术感染力，激发了建筑师、室内设计师、城市规划师对夜景照明创作的冲动。光是人居环境的要素，为人类居住的建筑和城市创造光明、舒适、绚丽。创造优美的光环境是建筑师、设计师义不容辞的责任。 光使建筑的实存成为可能。随着时间的变化，季节的更替，光的强弱发生了变化，建筑的形象也随之改变。人们就是在这样不断变化的形和影中感受光带给我们的奇妙世界。正如日本着名建筑大师安藤忠雄所说：“建筑设计就是要截取无所不在的光，并在特定场合去表现光的存在。建筑将光凝缩成最简约的存在，建筑空间的创造即是对光之力量的纯化和浓缩。” 大面积的明暗对比和光影变化，反映着光与建筑的完美交融。 记得老师在上课的时候讲过SOHO概念的例子，撇开功能不讲，自然光在其设计中就占有极其重要的地位，甚至以光为装饰。阳光感在小区环境景观中的体现则更为直接。环境作为小区的重要组成部分越来越受到人们的关注。人们对自然、阳光的渴望都直接反映在对环境景观的要求上。小区中的环境景观有别于自然环境，它是一种人造环境，是一种抽象化的自然，阳光作为自然要素之一，在这样特定的场所中，与人、建筑发生着关系，通过小区内小环境，让人感受到它的存在。由建筑围合的环境景观充当了阳光、雨水和风等自然要素的代言人，并成为居民生活体验的一部分。这里绝不是一个普通的可观赏树木的庭院，而是会有一种触动更深层情感的场所。在这样一个人与自然相结合的环境中，人在精神上达到了至高的享受。通过树种、树形的精心挑选和搭配，绿化、水景的合理布局，铺地、设施的巧妙安排等等，都可以在环境景观中体现到“阳光感”无处不在。另外在这个人造自然中，尽量创造出让人能感受阳光，聆听风声、雨声的场所，满足现代人生理、心理乃至精神上的渴望，使人们从日常生活的疲倦中解放出来。正如有些小区中设计的“阳光会所”、“阳光曲廊”等诸如此类的小品景观，让人充分与阳光、自然相交流，达到生理、心理和精神上的和谐统一。 光是建筑艺术的灵魂 光塑造形象：物的形象只有在光的作用下才能被视觉感知。正确地设光（指光量，光的性质和方向）能加强建筑造型的三维立体感，提升艺术效果，反之则导致形象平淡或歪曲。 光建构空间，明和暗的差异自然地形成室内外不同空间划分的心理暗示。光的微妙的强弱变化造就空间的层次感。 光渲染气氛：晴空万里，细雨连绵，不同的环境带给我们不同的心情，这当中光的变化起着重要作用。光渲染的气氛对人的心理状态和光环境的艺术感染力有决定性的影响。 光突出重点：没有重点就没有艺术而落人平庸。强化光的明暗对比能把表现的艺术形象或细节实现出来，形成抢眼的视觉中心。极高的对比还能产生戏剧性的艺术效果，令人激动。 光演现色彩：显色性好的人工光源可以象天然光一样真实地演现环境，人和物的缤纷色彩；显色性差的灯则造成颜色变异，丧失环境色彩的勉力。彩色灯光赋于光环境情感意识，使一些颜色响亮，但也会使一些颜色受到扭曲。 光装饰环境：光和影编织的图案，光洁材料反射光和折射光所产生的晶莹光辉，光有节奏的动态变化，灯具的优美造型都是装饰环境的宝贵元素，引人入胜的艺术焦点。 在以自然光源进行照明设计的时候，有一个办法可以采用，就是你要把整座建筑当作灯具，那么光源就在建筑物的外边，就是日光与天空的散光，接下来就可以考虑建筑物的开口部位，即门窗和天窗。 事实上建筑物的所有表面都在改变着光线，并将光线反射进窗户，照到物体上。自然光有两个组成部分，一个是日光， 另一个就是天空的散光。日光就是由太阳直接照射出来的光束；天空的散光就是空气中的微粒对阳光的散射。 设计人员必须清楚地意识到自然光直射与散射所产生的不同效果， 天空光的散射效果是光设计的背景，是基础，这一点是很多设计人员没有意识到的。 研究光与建筑的关系：其中包括 1、 光本身的性质（直射光、漫反射光、光的色彩，人工光、自然光）； 2、 光的形状与建筑物的洞口；洞口在墙面上的高低位置对室内光照的影响； 3、 光射入建筑后的光域范围； 4、 透光材料（全透、半透，材料的色彩对光色的影响）； 5、 室内不同形式、不同位置的承影面（墙面、地面、屋面）对室内光空间的影响； 6、 光在室内的明暗变化，小面积亮光与大面积光域对室内气氛营造的差别，可以用对比以营造空间变化。 通过研究以上6点光与建筑环境的关系，运用光与建筑的一些基本特性，最终去分析、思考我们要如何创造建筑内特定的光气氛。 建筑光环境设计在建筑节能方面同样大有可为。天然光是取之不尽，用之不竭的能源，要有效利用它。如果自然光能进入到某一空间， 那电光源就只能算是一个补充光源，进行定点照明，平衡一些亮度而已。 首先自然采光方面，应仔细考虑窗的面积及方位，并可设置反射阳光板；建筑内装修可采用浅色调，增加二次反射光线，通过这些手段保证获得足够的室内光线，并达到一定的均匀度，由此减少白天的人工照明，节省照明能耗。采光窗作为建筑构成一个元素，在艺术上应和建筑风格协调一致，在视觉上要求舒适，无眩光，功能上要考虑光、热与隔声的问题。建筑师根据不同建筑要求设计采光窗。目前除常见的侧窗和天窗外，天穹式采光窗、带反射挡光板的采光窗、阳光凹井采光窗、带跟踪阳光的镜面格栅窗和全反射采光窗使用也不少，呈现出采光窗多样化的发展趋势。 以往的建筑采光设计都是假定天空是阴天，不考虑直射阳光。这样的采光设计计算简单，对阳光多变带来的采光不稳定，过热、眩光等问题都回避掉了。随着技术的发展，特别是节能的影响，国际照明委员会编写了《国际采光指南》，为设计提供了设计依据和标准。利用晴天采光计算方法设计采光，约可减小15%的开窗面积，具有重要的节能和经济意义。另外直射阳光进入室内，不仅可给人们提供时间信息，多变的阳光和室内植物装饰，可增加室内视环境的情趣，赋于人有大自然的感受，可产生一种独特的艺术效果。 “自然光总是在不停地变化着，可以使建筑富于各种特征，在空间和光影的相互作用下，我们可以创造出戏剧性”……英国建筑师诺尔曼。福斯特这句话极好地表达出 “光”在设计师心目中的地位。 确实如此，我们稍做回想，就能历数出众多将“光”视为设计中不可或缺的重要元素的设计大师们：柯布西埃，路易。康，迈耶，贝律铭，安藤忠雄……，迈耶以光为笔，勾勒出浓淡相宜的“精致水墨”，贝律铭大方又不失细腻的光的塑造，安藤忠雄以光在无机墙面上描画的“动人表情”，简约而纯净的气息，一次次以它们令人震撼的艺术魅力展示光在建筑设计中的无穷潜力。 如果说大师们运用自然光表现空间和质感的惊人之笔给人以无限的启迪，那么居室环境中人工光技术运用的巨大进步则给我们展现了又一大可作为的天地。 光表现空间设计优秀的设计方案，首先对空间做慎重考虑，因为所有的建筑空间，无论有多少优点，难免有一些遗憾，首先要对其做扬长避短的再调整，即考虑对空间的二次创造，其中光对表现这种二次创造设计如强调空间、突出层次、虚化背景界限、深远空间等有极大的作用。 背景照明：使空间更人性化 背境照明的光线使房间充盈着柔和、迷人的光线，令空间人性化。为获得理想的背境光线，现代的照明设计采用反射自墙面和天花板的光线，这样就可以避免产生亮点，光线也不会在人的脸上产生阴影，从而达到令人满意的光线效果。背境照明的可以来自壁灯、吊灯或在橱柜、梁柱等高处光源。 重点照明：强化突出光线 重点照明采用精心布置的较为集中的光束照射某件物体、艺术品、盆景或某些建筑细部结构。主要目的是取得艺术效果。重点照明的设计常常使观赏者觉得光线是不太明亮的光源提供的，比如蜡烛或墙上的吊灯。嵌入式可调节照明装置、跟踪照明设备或可移动照明装置都可以提供重点照明的光线。 可以让灯光来营造出您所期望的情调和氛围，取得最动人、最富戏剧性的效果。正因为灯光具有如此魅力，可以根据各个房间和空间块面的特殊情形来进行照明规划。由于所要达到的意图和目标不同，设计方案自然也大相径庭。举例来说，如果一个房间没有必要突出家具物品陈设，便不妨采用漫射光照明，让柔和的光线遍洒每一个角落，而在那些放满艺术收藏品的区域，最有效的便是准确、直接的灯光投射，以突出主题。 一些公共活动场所（比如客厅、餐厅）需要有一种友好、亲切的气氛，产生这一效果的最好办法是选用传统的顶灯或枝形灯。如果还能辅以大落地窗，以便吸纳自然光线，效果则更佳。 有时，照明也有一些不寻常的用法。比如，把光源嵌在大理石楼梯的台阶内部，可以产生美丽的半透明光效。即使像台灯之类的家用照明用具，如果加以精心选择，所产生的投影效果和情调也会有很多变化。例如，手制羊皮纸灯罩和日本纸灯灯罩质地比较轻薄透明，光效透过它们射向四周，显得柔和、飘渺；而那些不太透光的灯罩会将光线向下聚拢，其效果与前者相比自然情趣迥异。要是灯架或灯罩上缺了这些饰物，如此丰富有趣的光影组合实在是难以企求的。 浴室的照明设计最好是或浪漫或平易的情调，复古的墙地砖在多层次灯光洋洋洒洒的照射下，带来了古典的美，而局部的投射光则将我们引入深邃。 光的装饰作用在现代居室设计中，光不再仅仅是照明作用，随着人们对环境气氛的要求越来越高，光所具有的装饰效果越来越多地被设计师们所运用，光有冷暖之分，有颜色，经过“裁剪”有形状，光与其他材质配合可共同演绎动人的场景效果。 光色最基础的便是冷暖，室内环境中只用一种色调的光源可达到极为协调的效果，如同单色的渲染，但若想有多层次的变化，则可考虑有冷暖光的同时使用。现代居室中考虑动用五颜六色的光营造温馨气氛的佳做举不胜举，例如淡黄色墙面和地面的房间，采用暖光源与地面石材相映，突出温暖气氛，而白色吊顶采用非直接照明用途的冷光源，达到了衬托暖光源的作用，是一种对比也是一种丰富。装饰照明的光色彩不同，人的视觉效果就不同。用照度适宜的中性白光照射白色或近似白色的墙面，会出现清洁、宽敞、明亮、醒目的效果。通常性况下，鲜艳、饱和、照度充足的彩光会带来健康、明亮、堆璨、瑰丽的效果，而光色不纯或照度不足的彩光则会造成不同程度的负面效果。如微弱的黄光会散发昏暗、暧昧的气息，暗淡的红光会渲染压抑、恐怖的气氛，幽暗的蓝绿光则会造成阴暗、诡秘的效果等等。 另外，照明效果直接受到建筑立面的材料材质的影响。不同颜色的墙面配合灯光给人以不同的感觉。粉刷墙壁应根据需要和条件选择适宜颜色的乳胶漆。一般用白色粉刷墙壁的居多。因为白色反光强，使房间显得洁净、宽敞、明亮，较适合小或暗的居室。淡橙色给人以热烈、愉快、兴奋和温暖的感觉，宜于冬季采用，如果更淡一些，便四季咸宜。红色刺激性较强，一般不宜用来粉刷房间。不过，如果用极淡的粉色浆刷墙，再配以各色灯泡，整个房间会造成热烈、温暖的气氛；用红色内墙乳胶漆来装饰结婚新房，更显得喜庆、热闹。淡蓝或淡绿，前者给人以清爽、开阔的感觉，后者具有安谧恬静的效果。南向的房间可用清淡些的色调，北向的房间宜用暖色调。房顶、墙壁、地面要依次渐变地布色，正如自然环境的过渡：天空的淡蓝，田野的浓绿，土地的黄褐。 光还可被“裁剪”成各种形状，或点，或绒，或面，光的边缘则可虚可硬，主要取决于受光面或是“穿过面” 的形状，如居室的门厅较为狭长，为了不使大门或客厅之间的连接看上去低矮、狭窄、冗长、阴暗，设计师通过大量用光，将其设计成了一个“光的环境”，一个处理精致的门厅走廊，从客厅往外看去，是另一处明亮、有趣的天地，而非简单地承担交通功能的走廊。 此外，光通过影对有质感肌理的材料表现的强化装饰效果，有时还会有意想不到的收获，如光与彩色玻璃的配合几乎可使任何色彩和花纹表现其绚丽多彩的装饰效果。 其实，最能影响室内环境的装饰项目就是光（照明），因为它在不同的程度上影响着我们的生活、工作与休闲。不同形式的照明会左右物体或空间的形象、色调以及它们给人留下的印象。照明既能营造也能破坏室内环境的气氛。 但实际情况常常是：建筑风格与结构已设计完成并付诸建筑实施，这时人们才想到照明，这是一个很大的错误。照明同其它因素一样，需要从设计之初就予与考虑。令人遗憾的是我们（建筑学、室内设计）在这方面缺乏训练与主动的学习思考，出色的照明设计应当把居住者所有的不同需求以及他们的生活方式考虑在内。（一些专业设计软件对光效果的设计分析帮助很大，如：3dsmax，Lightscape， finalrender，Vray， 但仍然需要掌握照明的理论和实践。） 总之，光在居室设计中的运用，令古今中外的很多设计师不断探索其神奇的魅力，当光被设计师们更好地利用并展现其魔力时，我们的生活空间将会创造得更美。
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高分辨率光学显微术在生命科学中的应用【摘要】 提高光学显微镜分辨率的研究主要集中在两个方面进行，一是利用经典方法提高各种条件下的空间分辨率，如用于厚样品研究的SPIM技术，用于快速测量的SHG技术以及用于活细胞研究的MPM技术等。二是将最新的非线性技术与高数值孔径测量技术（如STED和SSIM技术）相结合。生物科学研究离不开超高分辨率显微术的技术支撑，人们迫切需要更新显微术来适应时代发展的要求。近年来研究表明，光学显微镜的分辨率已经成功突破200nm横向分辨率和400nm轴向分辨率的衍射极限。高分辨率乃至超高分辨率光学显微术的发展不仅在于技术本身的进步，而且它将会极大促进生物样品的研究，为亚细胞级和分子水平的研究提供新的手段。【关键词】 光学显微镜；高分辨率；非线性技术；纳米水平在生物学发展的历程中显微镜技术的作用至关重要，尤其是早期显微术领域的某些重要发现，直接促成了细胞生物学及其相关学科的突破性发展。对固定样品和活体样品的生物结构和过程的观察，使得光学显微镜成为绝大多数生命科学研究的必备仪器。随着生命科学的研究由整个物种发展到分子水平，显微镜的空间分辨率及鉴别精微细节的能力已经成为一个非常关键的技术问题。光学显微镜的发展史就是人类不断挑战分辨率极限的历史。在400～760nm的可见光范围内，显微镜的分辨极限大约是光波的半个波长，约为200nm，而最新取得的研究成果所能达到的极限值为20～30nm。本文主要从高分辨率三维显微术和高分辨率表面显微术两个方面，综述高分辨率光学显微镜的各种技术原理以及近年来在突破光的衍射极限方面所取得的研究进展。1 传统光学显微镜的分辨率光学显微镜图像的大小主要取决于光线的波长和显微镜物镜的有限尺寸。类似点源的物体在像空间的亮度分布称为光学系统的点扩散函数(point spread function, PSF)。因为光学系统的特点和发射光的性质决定了光学显微镜不是真正意义上的线性移不变系统，所以PSF通常在垂直于光轴的x-y平面上呈径向对称分布，但沿z光轴方向具有明显的扩展。由Rayleigh判据可知，两点间能够分辨的最小间距大约等于PSF的宽度。根据Rayleigh判据，传统光学显微镜的分辨率极限由以下公式表示[1]：横向分辨率(x-y平面)：dx，y=■轴向分辨率(沿z光轴)：dz=■可见，光学显微镜分辨率的提高受到光波波长λ和显微镜的数值孔径等因素的制约；PSF越窄，光学成像系统的分辨率就越高。为提高分辨率，可通过以下两个途径：（1）选择更短的波长；（2）为提高数值孔径, 用折射率很高的材料。Rayleigh判据是建立在传播波的假设上的，若能够探测非辐射场，就有可能突破Rayleigh判据关于衍射壁垒的限制。2 高分辨率三维显微术在提高光学显微镜分辨率的研究中，显微镜物镜的像差和色差校正具有非常重要的意义。从一般的透镜组合方式到利用光阑限制非近轴光线，从稳定消色差到复消色差再到超消色差，都明显提高了光学显微镜的成像质量。最近Kam等[2]和Booth等[3]应用自适应光学原理，在显微镜像差校正方面进行了相关研究。自适应光学系统由波前传感器、可变形透镜、计算机、控制硬件和特定的软件组成，用于连续测量显微镜系统的像差并进行自动校正。 一般可将现有的高分辨率三维显微术分为3类：共聚焦与去卷积显微术、干涉成像显微术和非线性显微术。 共聚焦显微术与去卷积显微术 解决厚的生物样品显微成像较为成熟的方法是使用共聚焦显微术(confocal microscopy) [4]和三维去卷积显微术(three-dimensional deconvolution microscopy, 3-DDM) [5]，它们都能在无需制备样品物理切片的前提下，仅利用光学切片就获得样品的三维荧光显微图像。共聚焦显微术的主要特点是，通过应用探测针孔去除非共焦平面荧光目标产生的荧光来改善图像反差。共聚焦显微镜的PSF与常规显微镜的PSF呈平方关系，分辨率的改善约为■倍。为获得满意的图像，三维共聚焦技术常需使用高强度的激发光，从而导致染料漂白，对活生物样品产生光毒性。加之结构复杂、价格昂贵，从而使应用在一定程度上受到了限制。3-DDM采用软件方式处理整个光学切片序列，与共聚焦显微镜相比，该技术采用低强度激发光，减少了光漂白和光毒性，适合对活生物样品进行较长时间的研究。利用科学级冷却型CCD传感器同时探测焦平面与邻近离焦平面的光子，具有宽的动态范围和较长的可曝光时间，提高了光学效率和图像信噪比。3-DDM拓展了传统宽场荧光显微镜的应用领域受到生命科学领域的广泛关注[6]。 选择性平面照明显微术 针对较大的活生物样品对光的吸收和散射特性，Huisken[7]等开发了选择性平面照明显微术(selective plane illumination microscopy，SPIM)。与通常需要将样品切割并固定在载玻片上的方式不同，SPIM能在一种近似自然的状态下观察2～3mm的较大活生物样品。SPIM通过柱面透镜和薄型光学窗口形成超薄层光，移动样品获得超薄层照明下切片图像，还可通过可旋转载物台对样品以不同的观察角度扫描成像，从而实现高质量的三维图像重建。因为使用超薄层光，SPIM降低了光线对活生物样品造成的损伤，使完整的样品可继续存活生长，这是目前其他光学显微术无法实现的。SPIM技术的出现为观察较大活样品的瞬间生物现象提供了合适的显微工具，对于发育生物学研究和观察细胞的三维结构具有特别意义。 结构照明技术和干涉成像 当荧光显微镜以高数值孔径的物镜对较厚生物样品成像时，采用光学切片是一种获得高分辨3D数据的理想方法，包括共聚焦显微镜、3D去卷积显微镜和Nipkow 盘显微镜等。1997年由Neil等报道的基于结构照明的显微术，是一种利用常规荧光显微镜实现光学切片的新技术，并可获得与共聚焦显微镜一样的轴向分辨率。干涉成像技术在光学显微镜方面的应用1993年最早由Lanni等提出，随着I5M、HELM和4Pi显微镜技术的应用得到了进一步发展。与常规荧光显微镜所观察的荧光相比，干涉成像技术所记录的发射荧光携带了更高分辨率的信息。（1）结构照明技术：结合了特殊设计的硬件系统与软件系统，硬件包括内含栅格结构的滑板及其控制器，软件实现对硬件系统的控制和图像计算。为产生光学切片，利用CCD采集根据栅格线的不同位置所对应的原始投影图像，通过软件计算，获得不含非在焦平面杂散荧光的清晰图像，同时图像的反差和锐利度得到了明显改善。利用结构照明的光学切片技术，解决了2D和3D荧光成像中获得光学切片的非在焦平面杂散荧光的干扰、费时的重建以及长时间的计算等问题。结构照明技术的光学切片厚度可达，轴向分辨率较常规荧光显微镜提高2倍，3D成像速度较共聚焦显微镜提高3倍。（2）4Pi 显微镜：基于干涉原理的4Pi显微镜是共聚焦/双光子显微镜技术的扩展。4Pi显微镜在标本的前、后方各设置1个具有公共焦点的物镜，通过3种方式获得高分辨率的成像：①样品由两个波前产生的干涉光照明；②探测器探测2个发射波前产生的干涉光；③照明和探测波前均为干涉光。4Pi显微镜利用激光作为共聚焦模式中的照明光源，可以给出小于100nm的空间横向分辨率，轴向分辨率比共聚焦荧光显微镜技术提高4~7倍。利用4Pi显微镜技术，能够实现活细胞的超高分辨率成像。Egner等[8，9]利用多束平行光束和1个双光子装置，观测活细胞体内的线粒体和高尔基体等细胞器的精微细节。Carl[10]首次应用4Pi显微镜对哺乳动物HEK293细胞的细胞膜上离子通道类别进行了测量。研究表明，4Pi显微镜可用于对细胞膜结构纳米级分辨率的形态学研究。（3）成像干涉显微镜(image interference microscopy, I2M)：使用2个高数值孔径的物镜以及光束分离器，收集相同焦平面上的荧光图像，并使它们在CCD平面上产生干涉。1996年Gustaffson等用这样的双物镜从两个侧面用非相干光源（如汞灯）照明样品，发明了I3M显微镜技术(incoherent, interference, illumination microscopy, I3M），并将它与I2M联合构成了I5M显微镜技术。测量过程中，通过逐层扫描共聚焦平面的样品获得一系列图像，再对数据适当去卷积，即可得到高分辨率的三维信息。I5M的分辨范围在100nm内。 非线性高分辨率显微术 非线性现象可用于检测极少量的荧光甚至是无标记物的样品。虽有的技术还处在物理实验室阶段，但与现有的三维显微镜技术融合具有极大的发展空间。（1）多光子激发显微术：(multiphoton excitation microscope，MPEM)是一种结合了共聚焦显微镜与多光子激发荧光技术的显微术，不但能够产生样品的高分辨率三维图像，而且基本解决了光漂白和光毒性问题。在多光子激发过程中，吸收几率是非线性的[11]。荧光由同时吸收的两个甚至3个光子产生，荧光强度与激发光强度的平方成比例。对于聚焦光束产生的对角锥形激光分布，只有在标本的中心多光子激发才能进行，具有固有的三维成像能力。通过吸收有害的短波激发能量，明显地降低对周围细胞和组织的损害，这一特点使得MPEM成为厚生物样品成像的有力手段。MPEM轴向分辨率高于共聚焦显微镜和3D去卷积荧光显微镜。（2）受激发射损耗显微术：Westphal[12]最近实现了Hell等在1994年前提出的受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED）成像的有关概念。STED成像利用了荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系。STED技术通过2个脉冲激光以确保样品中发射荧光的体积非常小。第1个激光作为激发光激发荧光分子；第2个激光照明样品，其波长可使发光物质的分子被激发后立即返回到基态，焦点光斑上那些受STED光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的光点。Hell等已获得了28nm的横向分辨率和33nm的轴向分辨率[12,13]，且完全分开相距62nm的2个同类的分子。近来将STED和4Pi显微镜互补性地结合，已获得最低为28nm的轴向分辨率,还首次证明了免疫荧光蛋白图像的轴向分辨率可以达到50nm[14]。（3）饱和结构照明显微术：Heintzmann等[15]提出了与STED概念相反的饱和结构照明显微镜的理论设想，最近由Gustafsson等[16]成功地进行了测试。当光强度增加时，这些体积会变得非常小，小于任何PSF的宽度。使用该技术，已经达到小于50nm的分辨率。（4）二次谐波 (second harmonic generation, SHG)成像利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源。SHG一般为非共振过程，光子在生物样品中只发生非线性散射不被吸收，故不会产生伴随的光化学过程，可减小对生物样品的损伤。SHG成像不需要进行染色,可避免使用染料带来的光毒性。因其对活生物样品无损测量或长时间动态观察显示出独特的应用价值，越来越受到生命科学研究领域的重视[17]。3 表面高分辨率显微术表面高分辨率显微术是指一些不能用于三维测量只适用于表面二维高分辨率测量的显微技术。主要包括近场扫描光学显微术、全内反射荧光显微术、表面等离子共振显微术等。 近场扫描光学显微术 近场扫描学光显微术(near-field scanning optical microscope, NSOM)是一种具有亚波长分辨率的光学显微镜。由于光源与样品的间距接近到纳米水平，因此分辨率由光探针口径和探针与样品之间的间距决定，而与光源的波长无关。NSOM的横向分辨率小于100nm，Lewis[18]则通过控制在一定针尖振动频率上采样，获得了小于10nm的分辨率。NSOM具有非常高的图像信噪比，能够进行每秒100帧图像的快速测量[19]，NSOM已经在细胞膜上单个荧光团成像和波谱分析中获得应用。 全内反射荧光显微术 绿色荧光蛋白及其衍生物被发现后，全内反射荧光(total internal reflection fluorescence，TIRF)技术获得了更多的重视和应用。TIRF采用特有的样品光学照明装置可提供高轴向分辨率。当样品附着在离棱镜很近的盖玻片上，伴随着全内反射现象的出现，避免了光对生物样品的直接照明。但因为波动效应，有小部分的能量仍然会穿过玻片与液体介质的界面而照明样品，这些光线的亮度足以在近玻片约100nm的薄层形成1个光的隐失区，并且激发这一浅层内的荧光分子[20]。激发的荧光由物镜获取从而得到接近100nm的高轴向分辨率。TIRF近来与干涉照明技术结合应用在分子马达步态的动力学研究领域, 分辨率达到8nm，时间分辨率达到100μs[21]。 表面等离子共振 表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR) [22]是一种物理光学现象。当入射角以临界角入射到两种不同透明介质的界面时将发生全反射，且反射光强度在各个角度上都应相同，但若在介质表面镀上一层金属薄膜后，由于入射光被耦合入表面等离子体内可引起电子发生共振，从而导致反射光在一定角度内大大减弱，其中使反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随金属薄膜表面流过的液相的折射率而改变，折射率的改变又与结合在金属表面的生物分子质量成正比。表面折射率的细微变化可以通过测量涂层表面折射光线强度的改变而获得。1992年Fagerstan等用于生物特异相互作用分析以来，SPR技术在DNA-DNA生物特异相互作用分析检测、微生物细胞的监测、蛋白质折叠机制的研究，以及细菌毒素对糖脂受体亲和力和特异性的定量分析等方面已获得应用[23]。当SPR信息通过纳米级孔道[24]传递而提供一种卓越的光学性能时，将SPR技术与纳米结构设备相结合，该技术的深入研究将有可能发展出一种全新的成像原理显微镜。【参考文献】[1] 汤乐民,丁 斐.生物科学图像处理与分析[M].北京:科学出版社,2005：205.[2] Kam Z, Hanser B, Gustafsson MGL, et adaptive optics for live three-dimensional biological imaging[J]. 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